Mantarlarda CRISPR: Gen Düzenleme Nasıl Yapılıyor

Bir mantarın tek bir genini kapatmak, uzun yıllar boyunca sabır işiydi: doğru işaretleyici, doğru plazmit, binlerce protoplast ve çoğu zaman hedefi tutmayan bir rekombinasyon. CRISPR-Cas9'un mantar laboratuvarlarına girmesiyle bu iş, hedefi doğrudan gösteren bir kesme yöntemine dönüştü. Aşağıda sistemin mantar hücresinde nasıl kurulduğu, ip mantarlarından şapkalı mantarlara nasıl taşındığı ve ıslah çalışmalarında hangi sorulara yanıt verdiği, yayımlanmış çalışmalar üzerinden anlatılıyor.

Sistemin mantar hücresinde kurulması

CRISPR-Cas9'un iki parçası var: DNA'yı kesen Cas9 proteini ve onu genomda belirli bir diziye götüren kılavuz RNA. Mantarda iş, bu iki parçayı hücrenin okuyabileceği biçimde ifade ettirmekle başlıyor. İp mantarları için kurulan ilk sistemlerden birinde kılavuz RNA, RNA polimeraz II tarafından okunan bir transkriptten ribozimlerle kesilerek serbest bırakılmış ve tek bir plazmitle dönüştürülen altı türde RNA güdümlü mutagenez sağlanmıştır (Nødvig ve ark., 2015). Aynı dönemde Trichoderma reesei'de kodon uyarlanmış Cas9 ve in vitro yazılmış kılavuz RNA kullanılmış; sistem indüklenebilir Cas9 ifadesiyle denetlenebilir kılınmış ve kısa homoloji kollarıyla bile hedefe yönelik değişiklikler elde edilmiştir (Liu ve ark., 2015).

Parçaların hücreye nasıl sokulduğu da bir tercih konusu. Penicillium chrysogenum için geliştirilen takımda Cas9 proteini ve in vitro sentezlenmiş kılavuz RNA, önceden birleştirilmiş ribonükleoprotein olarak doğrudan hücreye verilebilmiş ya da hücre içinde AMA1 temelli bir plazmitten ifade ettirilmiştir; AMA1 vektöründen ifade, işaretleyici bırakmayan gen silmelerinde verimli bulunmuştur (Pohl ve ark., 2016). Bu iki yol, bugün mantar laboratuvarlarında hâlâ yan yana kullanılıyor. Genomun kendisinin nasıl okunduğu ise mantar genomu nasıl dizilenir yazısının konusu.

Şapkalı mantarlara geçiş

Bazidiyomiset mantarlarda iş daha yavaş ilerledi, çünkü protoplast dönüşümü düşük verimli ve promotörler tür başına ayrı ayrı aranıyor. Model tür Coprinopsis cinerea'da kriyoprezerve protoplastlarla kurulan yüksek verimli raportör denemesinde, CcDED1 promotörünün bu denemede alışılmış GPD2 promotörüne göre yedi kat güçlü olduğu görülmüş; Cas9 bu promotörle, kılavuz RNA ise türün kendi U6-snRNA promotörüyle ifade ettirildiğinde hiflerde ve primordiyumlarda GFP işlevinin kaybı saptanmıştır (Sugano ve ark., 2017).

Kültüre alınan türlerde ilk başarılı düzenlemelerden biri istiridye mantarındadır. Cas9 ve farklı kılavuz RNA'ları taşıyan plazmitler tek çekirdekli PC9 suşunun protoplastlarına aktarıldığında fcy1 ve pyrG hedeflerinde 5-florositozin ya da 5-floroorotik aside dirençli suşlar elde edilmiş, dizileme hedef bölgede küçük eklenme ve silinmeleri göstermiştir (Boontawon ve ark., 2021). Shiitake mantarında da aynı yaklaşım kurulmuş: türün kendi LeU6 promotörü bulunmuş, denenen sekiz kılavuz RNA'dan üçü eşleşme tipi geni LeA1 bölgesini bozmuş ve aşağı akış genlerinin ifadesinde değişiklik saptanmıştır (Moon ve ark., 2021). Ganoderma lucidum'da ise Cas9'un açtığı çift zincir kırıkları yüzde 96,7 sıklıkla homolog olmayan uç birleştirmesiyle onarılmış; ku70 geni bozulduğunda hedefe gen ekleme ve değiştirme sıklıkları sırasıyla yüzde 96,3 ve yüzde 93,1'e çıkmış, denetim suşunda bu değerler yüzde 3,3 ve sıfır kalmıştır (Tu ve ark., 2021).

Kesikten sonrası: iki onarım yolu

Cas9 yalnız keser; sonucu belirleyen, hücrenin kesiği hangi yolla kapattığıdır. Homolog olmayan uç birleştirmesi uçları doğrudan yapıştırır ve çoğu zaman küçük eklenme ya da silinmeler bırakır; homolojiye dayalı onarım ise verilen bir kalıbı kullanarak istenen diziyi yerleştirir. Ganoderma lucidum örneğinde bu tercihin sayısal ağırlığı ölçülmüş ve ku70 bozulmasıyla terazi homolojiye dayalı onarıma kaydırılmıştır (Tu ve ark., 2021). İstiridye mantarında da homolojiye dayalı onarımla fcy1 geninde hedeflenen bir değişiklik elde edilmiş, bunun yalnız gen bozmaya değil dışarıdan gen yerleştirmeye de yol açtığı bildirilmiştir (Boontawon ve ark., 2021).

Şapkalı mantarlarda ikinci bir zorluk çekirdek sayısı. Kültürdeki suşlar çoğunlukla iki ayrı çekirdek taşır ve klasik melezlemeyle her iki çekirdeğe mutasyon taşımak uzun sürer. Bir çalışmada dikaryotik PC9×#64 suşuna tek bir dönüşüm denemesinde plazmit temelli CRISPR-Cas9 uygulanmış, incelenen 38 dikaryotik dönüşümcünün sekizi bazidiyospor üretmemiş ve bunların yedisinde hedef mutasyonun her iki çekirdeğe girdiği görülmüştür (Yamasaki ve ark., 2022). İki çekirdekli yaşam biçiminin kendisi dikaryon nedir yazısında anlatılıyor.

Islah sorularına verilen yanıtlar

Düzenleme burada bir amaç değil, bir soru sorma yöntemi. Sporsuz suş arayışında istiridye mantarında bazidiyospor üretimini durduran gen sayısı uzun süre mer3 ve msh4 ile sınırlı kaldı; lamel dokusunda özgül ifade edilen genlerin taranmasıyla seçilen beş adaydan pcl1 ve cro6c kesildiğinde dikaryotik bozuntular spor üretmemiş, mikroskobik inceleme spor oluşumunun belirli evrelerde durduğunu göstermiştir (Kobukata ve ark., 2024). Aynı ekibin sonraki çalışmasında mek1 geni kesilen dikaryotik bozuntu da spor üretmemiş, mayozun telofaz I sırasında durduğu değerlendirilmiştir (Nakazawa ve ark., 2025). Bu hattın pratik karşılığı sporsuz istiridye suşları yazısında; klasik melezleme yöntemleri ise mantar ıslahı nedir yazısında ele alınıyor.

Bu denemelerde okunan bir başka şey de fenotipin nereye kadar izlenebildiği. Spor üretmeyen dikaryotik bozuntularda meyve gövdesinin yönelimi ve yer çekimine tepkisi de değişmiştir (Nakazawa ve ark., 2025). Yani kesilen gen, ıslahta istenen özelliğin yanında başka özellikleri de taşıyabiliyor; mikroskobik inceleme olmadan bunu görmek zor. Dikaryotik hifte kelepçe yapısının işlevi klamp bağlantısı nedir yazısında anlatılıyor.

Yöntemin sınırları

CRISPR bir mantarda çalıştı diye ötekinde çalışmıyor. Promotörler, kodon kullanımı, protoplast verimi ve seçici işaretleyici her tür için yeniden ayarlanıyor; yayımlanan sistemlerin çoğu model suşlarda ve laboratuvar koşullarında kurulmuş durumda. Elde edilen suşların tarlaya ya da üretim tesisine çıkması ise ülkeden ülkeye değişen düzenleyici çerçevelere bağlı ve bu yazının kapsamı dışında. Suşlar arasındaki doğal farkların ne kadar büyük olabileceği tür içi varyasyon ve suş önemi yazısında anlatılıyor. Klasik melezleme ile moleküler düzenleme, şimdilik birbirinin yerini almadan yan yana yürüyor.

Bilimsel referanslar

Boontawon, T. et al. (2021). Efficient genome editing with CRISPR/Cas9 in Pleurotus ostreatus. AMB Express, 11(1), 30. PMID 33609205. DOI 10.1186/s13568-021-01193-w.

Kobukata, T. et al. (2024). Identification of two genes essential for basidiospore formation during the postmeiotic stages in Pleurotus ostreatus. Fungal Genet Biol, 172, 103890. PMID 38503389. DOI 10.1016/j.fgb.2024.103890.

Liu, R. et al. (2015). Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discov, 1, 15007. PMID 27462408. DOI 10.1038/celldisc.2015.7.

Moon, S. et al. (2021). Construction of a CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing System in Lentinula edodes. Mycobiology, 49(6), 599-603. PMID 35035251. DOI 10.1080/12298093.2021.2006401.

Nakazawa, T. et al. (2025). Pleurotus ostreatus mek1 is essential for meiosis and basidiospore production. Fungal Biol, 129(3), 101562. PMID 40222769. DOI 10.1016/j.funbio.2025.101562.

Nødvig, C.S. et al. (2015). A CRISPR-Cas9 System for Genetic Engineering of Filamentous Fungi. PLoS One, 10(7), e0133085. PMID 26177455. DOI 10.1371/journal.pone.0133085.

Pohl, C. et al. (2016). CRISPR/Cas9 Based Genome Editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synth Biol, 5(7), 754-764. PMID 27072635. DOI 10.1021/acssynbio.6b00082.

Sugano, S.S. et al. (2017). Genome editing in the mushroom-forming basidiomycete Coprinopsis cinerea, optimized by a high-throughput transformation system. Sci Rep, 7(1), 1260. PMID 28455526. DOI 10.1038/s41598-017-00883-5.

Tu, J.L. et al. (2021). Targeted Gene Insertion and Replacement in the Basidiomycete Ganoderma lucidum by Inactivation of Nonhomologous End Joining Using CRISPR/Cas9. Appl Environ Microbiol, 87(23), e0151021. PMID 34524900. DOI 10.1128/AEM.01510-21.

Yamasaki, F. et al. (2022). Gene targeting of dikaryotic Pleurotus ostreatus nuclei using the CRISPR/Cas9 system. FEMS Microbiol Lett, 369(1), fnac083. PMID 36001999. DOI 10.1093/femsle/fnac083.

Bu içerik bilgilendirme amaçlıdır, tıbbi tavsiye niteliği taşımaz. Herhangi bir sağlık kararı almadan önce hekiminize danışınız. Fonksiyonel mantarlar ilaç değildir ve hastalıkların tedavisinde kullanılamaz.

Atıf yapılan kaynak: 10  |  Yöntem: Editöryel Politika  |  Referanslar: Bibliyografya