Mantarlarda DNA Barkodlama: ITS Bölgesiyle Tür Doğrulama

Bir mantar tohumluğunun hangi türe ait olduğunu kültürdeki özelliklerine ve görünümüne bakarak belirlemek zaman alır ve kimi zaman son derece zordur; istiridye mantarı tohumlukları üzerine yapılan bir çalışma bu güçlüğün ıslah çalışmalarını aksattığını ve yetiştiricilere ekonomik kayıp yaşattığını yazar (Zhao ve ark., 2021). İşlenmiş bir materyalde bakılacak biçim bile kalmaz. DNA barkodlama bu soruya laboratuvarda cevap arar: materyalden kısa bir DNA bölgesi okunur ve güvenilir referans dizilerle karşılaştırılır.

DNA barkodu ne demek?

DNA dizileri birçok canlı grubunda tür tanımlamanın temel bilgi kaynaklarından biri hâline gelmiştir ve barkodlama olarak bilinen bu yaklaşım, karşılaştırmada kullanılan referans veritabanlarının yeterince eksiksiz ve doğru adlandırılmış kayıtlar içerdiği varsayımına dayanır (Nilsson ve ark., 2006). Hayvanlarda kullanılan mitokondriyal COI bölgesi mantarlar için elenmiştir, çünkü mantarlarda çoğaltılması zordur, sıklıkla büyük intronlar içerir ve yeterince değişken olmayabilir (Schoch ve ark., 2012).

Çok uluslu bir konsorsiyum mantarlar için altı DNA bölgesini barkod adayı olarak değerlendirmiştir (Schoch ve ark., 2012):

Bu değerlendirmenin sonunda ITS birincil mantar barkodu olarak önerilmiş, dar tanımlı gruplar için ek barkodlar geliştirilebileceği de not edilmiştir (Schoch ve ark., 2012).

Laboratuvarda nasıl işler?

Bir derleme süreci şu parçalarla anlatır: resmi barkod olan ITS'in avantaj ve sınırları, NCBI-BLAST aramasının sınırlarına dair uyarılar, küratörlü veritabanları, ITS'i destekleyen protein kodlayan genler ve filogenetik ağaçlar (Raja ve ark., 2017). Aynı derleme mümkün olduğunda morfolojik ve moleküler verinin birlikte kullanılmasını önerir (Raja ve ark., 2017).

"Aynı tür" demek için dizilerin ne kadar benzemesi gerektiği de ölçülmüştür. Büyük bir mantar biyobankasını barkodlayan projede 7.300 kabul görmüş türe ait doğrulanmış suşların 24.000'i aşkın dizisiyle ipliksi mantarlar için uygun eşik ITS'te yüzde 99,6, LSU'da yüzde 99,8 olarak hesaplanmıştır (Vu ve ark., 2019). Aynı veri setinde türlerin yüzde 17'si ITS ile, yüzde 18'i LSU ile ayırt edilememiş; doğru tanımlama olasılığı ITS için yüzde 82, LSU için yüzde 77,6 bulunmuştur (Vu ve ark., 2019).

Karşılaştırmanın öbür yarısı: referans veritabanı

Barkodun değeri karşılaştırıldığı kayıt kadardır. Uluslararası nükleotit veritabanındaki mantar dizileri incelendiğinde tür örneklemesinin eksik olduğu, kayıtların yaklaşık yüzde 20'sinin tür düzeyinde yanlış adlandırılmış olabileceği ve çoğunun açıklayıcı, güncel bilgi taşımadığı görülmüştür (Nilsson ve ark., 2006). Yazarlar barkodlamanın önündeki asıl güçlüğün teknik değil taksonomik olduğunu vurgular (Nilsson ve ark., 2006).

Küratörlü kaynaklardan biri olan UNITE, ITS bölgesini hedefler; son sürümde yaklaşık 10 milyon diziyi, her birine kalıcı bir tanımlayıcı atanan yaklaşık 2,4 milyon tür hipotezinde kümelemiş ve kullanıcılardan 600.000'i aşkın ek açıklama almıştır (Abarenkov ve ark., 2024). Topraktaki bütün mantar DNA'sının taranması ise ayrı bir uygulama: toprak mikrobiyomu ve mantar çeşitliliği ile dünyada kaç mantar türü var yazılarında.

ITS'in sınırları: tür içi ve genom içi çeşitlilik

ITS'in tür içindeki değişkenliği çoğu zaman sınırlı ve türler arası farktan net biçimde ayrılmış kabul edilir (Nilsson ve ark., 2008). Veritabanlarındaki bütün mantarlar için yapılan bir tahmin ise âlem içinde belirgin farklar bulmuş ve yaygın kullanılan yüzde 3 gibi tek ve katı bir üst sınırın bütün mantarlarda istenen sonucu verecek biçimde uygulanabilir görünmediğini bildirmiştir (Nilsson ve ark., 2008). Yazarlar otomatik, basitleştirilmiş ITS temelli tür ayrımına karşı uyarır ve dizi verisini tür adına çevirirken taksonomi uzmanlığının gerekli olduğunu yineler (Nilsson ve ark., 2008).

Sorun tek bir genomun içinde de başlayabilir. Laetiporus ve Wolfiporia cinslerinden saf kültürlerde ITS kopyaları tek tek klonlanıp dizilendiğinde, 1399 dizinin incelendiği çalışmada altı kültürde kopyalar arasında yüzde 5 ya da daha fazla fark görülmüştür (Lindner ve ark., 2011). Yüzde 95 benzerlik sınırıyla bu cinste uzlaşı dizileri 7, klonlanmış diziler ise 20 operasyonel taksonomik birim üretmiş; yazarlar bunun barkodlama girişimleri için de sorun yaratabileceğini belirtmiştir (Lindner ve ark., 2011). Aynı türün suşları arasındaki farkların üretim açısından anlamı tür içi varyasyon ve suş önemi yazısında ele alınıyor.

İkincil barkodlar: ITS yetmediğinde

1500'ü aşkın türden 1931 suş ya da örnek üzerinde 19.577 PCR tepkimesinin değerlendirildiği bir çalışma, sekiz genetik işaretleyiciyi hedefleyen primer çiftlerini ek barkod adayı olarak sınamıştır (Stielow ve ark., 2015). Bu çalışmada TEF1α için geliştirilen yeni bir primer çifti ITS'ten daha iyi ayırma gücüyle tamamlayıcı barkod olarak öne çıkmış, TOPI ve PGK bölgeleri askomisetler için umut verici bulunmuştur (Stielow ve ark., 2015).

Kültür mantarından bir örnek: 13 istiridye mantarı türünden 160 dizinin karşılaştırıldığı çalışmada EF-1α türlerin yüzde 84,6'sını ayırt etmiş, ITS için bu oran yüzde 61,5, 28S rDNA için yüzde 46,2 kalmıştır (Zhao ve ark., 2021). Aynı çalışmada bazı türlerde ITS ve 28S rDNA'nın tür içi farkları türler arası farklardan belirgin biçimde büyük çıkmış ve yazarlar tohumluk kimliğinin doğrulanması için EF-1α'yı olası bir barkod olarak önermiştir (Zhao ve ark., 2021). Tohumluğun sıvı kültürde nasıl çoğaltıldığı sıvı kültür ve batık fermantasyon yazısının konusu.

Barkod neyi söyler, neyi söylemez?

Barkod sonucu, incelenen örnekten okunan dizinin hangi referans kayıtlarla ne ölçüde örtüştüğünü söyler; eşleşmenin güvenilirliği yukarıdaki eşiklere, seçilen bölgeye ve referans kaydın doğruluğuna bağlıdır. Bileşen miktarı ya da kalite bu testin sorusu değildir. Yöntem arazide mantar tanımanın da yerine geçmez: yabani mantar toplamak uzman işidir ve bu konudaki çerçeve Türkiye'deki yabani mantarlar yazısında.

Bilimsel referanslar

Abarenkov, K. et al. (2024). The UNITE database for molecular identification and taxonomic communication of fungi and other eukaryotes: sequences, taxa and classifications reconsidered. Nucleic Acids Res, 52(D1), D791-D797. PMID 37953409. DOI 10.1093/nar/gkad1039.

Lindner, D.L. et al. (2011). Intragenomic variation in the ITS rDNA region obscures phylogenetic relationships and inflates estimates of operational taxonomic units in genus Laetiporus. Mycologia, 103(4), 731-40. PMID 21289107. DOI 10.3852/10-331.

Nilsson, R.H. et al. (2006). Taxonomic reliability of DNA sequences in public sequence databases: a fungal perspective. PLoS One, 1(1), e59. PMID 17183689. DOI 10.1371/journal.pone.0000059.

Nilsson, R.H. et al. (2008). Intraspecific ITS variability in the kingdom fungi as expressed in the international sequence databases and its implications for molecular species identification. Evol Bioinform Online, 4, 193-201. PMID 19204817. DOI 10.4137/ebo.s653.

Raja, H.A. et al. (2017). Fungal Identification Using Molecular Tools: A Primer for the Natural Products Research Community. J Nat Prod, 80(3), 756-770. PMID 28199101. DOI 10.1021/acs.jnatprod.6b01085.

Schoch, C.L. et al. (2012). Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proc Natl Acad Sci U S A, 109(16), 6241-6. PMID 22454494. DOI 10.1073/pnas.1117018109.

Stielow, J.B. et al. (2015). One fungus, which genes? Development and assessment of universal primers for potential secondary fungal DNA barcodes. Persoonia, 35, 242-63. PMID 26823635. DOI 10.3767/003158515X689135.

Vu, D. et al. (2019). Large-scale generation and analysis of filamentous fungal DNA barcodes boosts coverage for kingdom fungi and reveals thresholds for fungal species and higher taxon delimitation. Stud Mycol, 92, 135-154. PMID 29955203. DOI 10.1016/j.simyco.2018.05.001.

Zhao, P. et al. (2021). DNA Barcoding Mushroom Spawn Using EF-1α Barcodes: A Case Study in Oyster Mushrooms (Pleurotus). Front Microbiol, 12, 624347. PMID 34093459. DOI 10.3389/fmicb.2021.624347.

Bu içerik bilgilendirme amaçlıdır, tıbbi tavsiye niteliği taşımaz. Herhangi bir sağlık kararı almadan önce hekiminize danışınız. Fonksiyonel mantarlar ilaç değildir ve hastalıkların tedavisinde kullanılamaz.

Atıf yapılan kaynak: 9  |  Yöntem: Editöryel Politika  |  Referanslar: Bibliyografya